谷氨酰胺转移酶
米糠是稻谷碾米加工过程中的主要副产物，约占整个糙米产量的8%～10%，我国年产米糠1 000万 t以上。国内外研究表明米糠是最具开发潜力的一种高附加值的资源，它不仅有高含量的脂肪和蛋白质，而且还含有抗微生物、抗癌和其他能促进健康的功能物质。如何提高米糠蛋白的溶出得率和改善其功能特性，成为国内外研究热点。在米糠蛋白的生产中，会排放出大量米糠废水，采用传统的废水处理工艺对米糠废水的处理会使废水中含有的多种营养物质被浪费。
转谷氨酰胺酶（蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷氨酰胺基转移酶，MTG；EC2.3.2.13）是一种能催化转酰基反应，催化蛋白质中赖氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-羟酰胺基之间的结合反应，从而导致蛋白质（或多肽）之间发生共价交联形成共价化合物的聚合酶，所以它可催化蛋白质中多肽发生酰基转移反应，从而使米糠废水中蛋白分离出来。经MTG交联形成的米糠蛋白聚合物具有良好的水溶性、乳化性以及稳定性而广泛应用在食品行业，它一方面改善食品的物性，另一方面优化食品的质构和感官。醋酸纤维素-聚丙烯复合膜具备良好的疏水性、吸附性以及化学稳定性等优点，并且能将酶的催化特性和膜的优良分离性能有机地结合起来，构成酶膜生物反应器，在工业生产中被广泛使用。
东北农业大学食品学院的裴兴武、汪鸿、潘明喆*和于殿宇*等人通过制备醋酸纤维素-聚丙烯复合膜，并将转谷氨酰胺酶进行膜固定化，依据最佳条件制得固定化转谷氨酰胺酶膜，对固定化酶膜进行表征分析。并且通过将制备好的固定化转谷氨酰胺酶膜固定在不锈钢网框上悬挂于烧杯中用来聚合米糠废水中的蛋白质。在一定转速条件下，利用响应面确定物料温度、物料pH值、转子转速、酶膜面积与底物含量的比例和反应时间等最佳条件，并以蛋白聚合率为指标，研究固定化转谷氨酰胺酶催化米糠废水中米糠蛋白聚合率的影响，为连续化保留米糠废水中的蛋白提供理论依据。
1. 酶膜的酶载量以及酶活力
依据文章中相关酶载量以及酶活力测定的方法，测得单位面积酶载量为0.81 mg/cm2，酶活力为17.6 U/g。固定化酶的活力相较于游离酶的活力有所降低，主要是因为固定化过程会损伤一定的酶活。
2. 酶膜的扫描电镜
分别对制得的空白膜及固定化转谷氨酰胺酶膜做扫描电镜，结果如图1所示。
从图1a可以看出，空白醋酸纤维素-聚丙烯复合膜呈现纤维状，纤维相互错乱交叉，排列不规则，但表面很平整光滑、致密、均匀，代表稳定性好。从图1b可看出，此时酶蛋白固定化后的膜表面由于交联了蛋白的基团，存在一些颗粒或团状的物体而显得有些粗糙，而且这些颗粒大小不一，形状各异，附着在纤维表面，并且纤维表面大部分被酶覆盖。可以说明MTG已经固定在醋酸纤维素-聚丙烯复合膜上。
3. 酶膜处理米糠废水的单因素试验
将固定有酶膜的网框悬挂在烧杯中，控制米糠废水的反应pH 6.5、转子转速125r/min、酶膜面积与底物含量比例80∶1（cm2/g）、反应时间1.5 h。
3.1物料温度对蛋白聚合率的影响
结果显示，蛋白聚合率随温度变化的趋势为先快速增高后趋于平稳。当物料温度小于42 ℃时，蛋白聚合率很明显地随物料温度的升高而升高，说明酶膜活性随温度的升高不断增强，与废水中的蛋白充分聚合，从而分离下来。但物料温度升至42 ℃时蛋白聚合率达到65%，温度继续升高蛋白聚合率趋势稳定，并没有显著变化。因此本实验把物料温度确定在42 ℃左右。
3.2 物料pH值对蛋白聚合率的影响
结果显示，蛋白聚合率随pH值的升高呈现先增大后减小的趋势。当pH值为5.5～6.5之间时蛋白聚合率随pH值的升高而升高，pH值为6.5时蛋白聚合率最高达68%，而当pH值继续升高，蛋白聚合率下降。由此可见，在强酸、强碱性条件下会破坏酶的活性位点，从而使酶失活，不利于酶膜发挥聚合作用，对米糠蛋白的聚合效果较差。从而得知酶膜的最佳反应pH值在中性条件附近，所以选取pH值在6.5左右。
3.3 转子转速对蛋白聚合率的影响
结果显示，当调节转子转速时，蛋白聚合率呈现先较上升后下降的趋势。当调节转速在95～125 r/min时，蛋白聚合率随转子转速的增大而增大，因为适当的搅拌效果可以使废水中的蛋白与酶膜充分接触，从而提高聚合率。当转子转速大于125 r/min时，随着转子转速的增大，蛋白聚合率反而下降，强力的搅拌使得废水中的蛋还未与酶膜充分接触聚合，从而造成聚合率降低。所以，将转子转速确定在125 r/min附近。
3.4 酶膜面积与底物含量比例对蛋白聚合率的影响
结果显示，蛋白质聚合率随其比例的增大呈现先增加后趋于平稳的趋势。当比例小于80∶1 （cm2/g）时，随着酶膜面积的增大，会提供更多的聚合位点聚合废水中的蛋白质，蛋白质聚合率相应地提高。当比例大于80∶1（cm2/g）时，此时废水中的蛋白质含量一定，过多的酶膜面积起不到聚合蛋白质的作用，从而造成酶膜的浪费。所以，选择酶膜面积与底物含量比例在80∶1（cm2/g）左右。
3.5 反应时间对蛋白聚合率的影响
结果显示，蛋白质聚合率随反应时间的增大呈现先增加后趋于稳定的趋势。当反应时间在1.5 h之前，因为反应未达到充分，样品中蛋白并没有被全部聚合，所以出现随时间延长而增大的现象。当反应时间在1.5 h之后，样品中蛋白被聚合完全，蛋白聚合率趋于平稳，继续增大反应时间并不能取得更好的效果，所以，选取反应时间在1.5 h左右。
4. 响应面试验优化
4.1 响应面试验设计与结果
通过Design-Expert 8.0.6软件设计设定A（物料温度）、B（物料pH）、C（转子转速）、D（酶膜面积与底物含量比例）、E（反应时间）分别是影响因素，Y（蛋白聚合率）为响应值得到5因素3水平设计与结果。
4.2 模型方差与分析
利用Design Expert 8.0.6软件对4.1节中实验结果进行方差分析，得到回归线方程为：
结果显示，回归模型中以蛋白聚合率为响应值的F值为71.05，P＜0.000 1，表明在利用回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，因变量与所有自变量之间的线性关系显著，说明得到的回归方程可靠。通过方差分析失拟项大于0.05，表明此差异不显著，说明回归区域内拟合良好，该模型选择正确。多元相关系数R2=98.27%＞0.8，表明在此模型中各个因素和响应值之间相关性好，可以通过此模型分析和预测蛋白聚合率。
4.3 交互参数的等高线图
由图7可知，物料温度、物料pH值、转子转速、酶膜面积与底物含量的比例以及反应时间5 个变量在交互时，控制3个变量恒定，随着其他2 个变量的增加，呈现先上升后下降的趋势。在交互结果中，AD、BC显示极显著，AB、AC、BD显著，即物料温度和酶膜面积与底物含量的比例、物料pH值和转子转速之间交互极显著，而物料温度和物料pH值、物料温度和转子转速、物料pH值和酶膜面积与底物含量的比例之间交互显著。通过响应面设计优化得到最佳条件为物料温度42.9 ℃、物料pH6.60、转子转速123.7 r/min、酶膜面积与底物含量的比例80.23∶1（cm2/g）、反应时间1.81 h，在此条件下得到蛋白质聚合率为70.1%。根据实际情况得出整理值，整理值为物料温度43 ℃、物料pH6.6、转子转速124 r/min、酶膜面积与底物含量的比例80∶1（cm2/g）、反应时间1.8 h。在此整理条件下，做3次平行试验，蛋白质聚合率平均值为70%，进一步说明此回归模型建立良好，与实际值相吻合，可以用来分析和预测蛋白质聚合率。
5. 酶膜的重复使用次数
在上述响应面优化最佳条件下考察重复使用次数对固定化酶膜的相对酶活力的影响。结果显示，酶膜的相对酶活力呈现随操作次数的增加而降低的趋势，经10 次使用后，相对酶活力为51.5%。在图中可以看出，酶膜在重复使用5 次后，相对酶活力仍可保持在74.3%以上。
6. 主要指标对比
米糠废水中主要指标在处理前后有一定的变化，成分变化显示，处理后比处理前蛋白质、COD值和BOD值各个指标均有相对显著幅度的下降，表明此次实验良好，利用醋酸纤维素-聚丙烯膜固定转谷氨酰胺酶对米糠废水中蛋白的聚合起到了良好的效果。
结 论
本实验首先制备了醋酸纤维素-聚丙烯复合膜，将转谷氨酰胺酶固定在复合膜上，制得了固定化转谷氨酰胺酶膜，其单位面积酶载量为0.81 mg/cm2，并对酶膜进行表征分析。然后将酶膜固定在网框上并悬挂于烧杯中，用来聚合米糠废水中的蛋白质，以米糠废水中的蛋白质聚合率为指标，分别考察物料温度、物料pH值、转子转速以及酶膜面积对蛋白质聚合率的影响，并利用响应面对各个条件进行优化，得到最佳条件。在物料温度43 ℃、pH 6.6、转子转速124 r/min、酶膜面积与底物含量比例80∶1（cm2/g）、反应时间1.8 h条件下，蛋白质聚合率可达70%，表明本实验有效保留了米糠废水中的蛋白质含量，相应米糠废水中相关指标也有所降低：COD值为3 859 mg/L，BOD为1 982 mg/L。与此同时，对酶膜重复使用性进行了实验，在使用5 次后，酶膜的相对酶活力为74.3%。本实验为之后利用酶膜降低米糠废水中蛋白质含量从而保留更多营养物质提供一定的研究基础和理论依据。
本文《转谷氨酰胺酶的固定化及其在处理米糠废水中的应用》来自于《食品科学》2019年40卷22期110-117页，作者：裴兴武，汪鸿，高子雯，袁泰增，高明，姚凯，潘明喆，于殿宇。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190520-225。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅
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